核酸合成试剂篇（一）- 脱保护试剂
SYNTHESIS
核酸合成试剂篇(一）-脱保护试剂
Deprotection Reagent
在核酸的固相合成中，脱保护是第一个执行的反应，其基本原理是使用有机酸对核苷 5’ 羟基上的 4, 4’-二甲氧基三苯甲基（4, 4’-dimethoxytrityl，DMT）基团进行脱除，将核苷上 5’ 羟基裸露出来，以便进行下一步的缩合反应（下图1）。
图1. 核酸 5’ 羟基的脱保护
DMT 基团被酸切除后生成 4, 4’-二甲氧基三苯甲基碳正离子，该离子在有机溶剂中为橙红色，紫外吸收在 490 nm 左右，因此可以使用紫外-可见吸收光谱来对脱除的 DMT 碳正离子进行定量，进而判定上一步的缩合效率，如下图2。
图2. 三苯甲基碳正离子的颜色
注：
MMT为4-monomethoxytrityl，4-甲氧基三苯甲基；
TMT 为 4, 4’, 4’’-trimethoxytrityl，4, 4’, 4’’-三甲氧基三苯甲基。
目前脱保护试剂应用最多的是 3% 三氯乙酸的二氯甲烷溶液，该浓度下的三氯乙酸可以高效脱除核苷 5’ 羟基上的 DMT 基团。但是嘌呤类核苷（如 A 和 G）中的核苷键在强酸作用下会发生不可逆的脱嘌呤反应（下图3），这将对核酸的最终得率和纯度造成很大的影响。
因此在某些长链核酸的合成工艺中，研究人员选用了 2.5-3% 的二氯乙酸的二氯甲烷溶液，由于二氯乙酸的酸性（pKa为 1.30）要弱于三氯乙酸（pKa为 0.64），所以在合成过程中基本不发生脱嘌呤副反应。目前二氯乙酸的脱保护试剂已经开始广泛应用。
图3. 酸催化的脱嘌呤反应（以dA为例）
在核酸的大规模合成中，溶剂的选择和使用是一个不可忽视的问题。二氯甲烷是化工生产中的重要溶剂，但是作为含氯溶剂，其对地下水的污染严重，后处理工艺复杂，无害化处理的成本较高。
随着近年来环保要求的提高，越来越多的化工企业开始考虑如何替代掉二氯甲烷。连年来，多家企业开始使用甲苯来替代二氯甲烷，减少核酸合成工艺中的后处理成本，如使用 3% 三氯乙酸的甲苯溶液做为脱保护试剂，基本实现了和传统脱保护试剂一样的效果。
使用甲苯作为脱保护试剂的溶剂时，DMT 碳正离子的稳定性要优于其在二氯甲烷中的稳定性，因此利用电导法来测定 DMT 碳正离子在溶剂中的浓度，进而确定脱保护步骤中的转化率。