核酸固相合成原理（二）
SYNTHESIS
核酸固相合成原理（二）
Nucleic acid synthesis II
核酸的固相合成是一个重复进行的反应，在固相载体上每连接一个核苷酸单元，都要重复四个反应（脱保护、缩合、封端和氧化/硫代），所以，在假定每一个核苷的合成效率都一致的前提下，固相合成核酸的总收率和每个核苷酸的连接效率之间是指数倍的关系（图1）。
图1. 核酸的合成效率
合成总效率 = (单步合成效率)合成步骤≈核苷酸数目
因此长链核酸的合成得率和单步反应效率密切相关，一般认为 40 nt 的单链合成总收率在 15-20% 之间，实际单步效率 95-97%。目前市面上的核酸合成设备可以实现 200 nt 单链核酸的合成，但是实际得率并不高。
当核酸合成完成后，需要将核酸链从固相载体上氨解下来（图2中橙色部分），得到粗产品核酸。氨解的另外两个作用是将核苷酸碱基上的保护基团切除（图2中红色部分），以及将磷酸三酯上的氰乙基（图2中蓝色部分）切除，生成磷酸二酯键。氨解的条件一般是 25% 的氨水在 60 ˚C 下水解 2 小时，为了加速氨解，也可以使用氨水和甲胺水溶液等体积的混合氨溶液（AMA）进行氨解。在高通量核酸合成中，为了加快氨解的速率，也可以使用氨气替代氨水进行氨解，该工艺需要使用压力设备。
图2. 合成完毕后核酸氨解的基本原理（以脱氧腺苷dA为例）
目前应用最多的碱基保护基团有，苯甲酰基（Bz，主要用于 A 碱基保护），乙酰基（Ac，主要用于 C 碱基保护），异丁酰基（iBu，主要用于 G 碱基保护）。随着核酸化学的发展，研究人员开发出了多种碱基上的保护基团，来满足不同条件下的合成需求（见表1）。其中苯氧乙酰基（Pac, iPac 和 tPac 等）可用于 A，C 和 G 碱基的保护，该类保护基在室温下即可使用氨水脱除，属于快脱保护基团，该类亚磷酰胺单体也被称为 UltraMild 单体。UltraMild 单体的反应活性与普通单体相当，但是在执行 Cap 操作时，需要使用专用的 Cap A 试剂。
表1. 碱基上不同结构的保护基团脱保护条件
注：APA为氨水和丙胺等体积的混合溶液。