核酸固相合成原理（一）
SYNTHESIS
核酸固相合成原理（一）
Nucleic acid synthesis I
核酸的合成主要有生物法合成和化学法合成两大类方法。生物法合成是以三磷酸核苷（NTP）作为原料，以互补链作为模板，在核酸聚合酶的作用下进行聚合来制备核酸。化学法合成是以核苷的亚磷酰胺单体作为原料，在载体上固相合成来实现的。固相合成的基本原理（如图1）所示。
图1. 核酸的固相合成原理
核苷亚磷酰胺的典型化学结构（如图2）所示，其以核苷作为基本单元，在其5’端羟基引入4, 4’-二甲氧基三苯甲基（DMT）作为羟基的保护单元，3’端引入N,N’-二异丙胺基-O-氰乙基亚磷酰胺作为活性单元，在碱基的胺基（在脱氧腺苷dA中为6-NH2）上引入酰胺键，来避免胺基参与过多的副反应。
图2. 脱氧核苷亚磷酰胺的化学结构(以脱氧腺苷dA为例)
化学法合成一般需要再固相载体上进行，固相载体主要有多孔玻璃微球（controlled pore glass, CPG）和聚苯乙烯（polystyrene, PS）微球两大类。CPG 是一类具有大量孔道的硅基材料（如图3所示），需要在其表面上进行化学修饰才可以用于核酸的固相合成。CPG 具有良好的化学稳定性和机械强度，适用于各种规模的核酸合成。其孔径和载量以及合成序列的长度具有直接关系，CPG 孔径越小，负载量越高，但是仅能用于短链核酸的合成；CPG 孔径越大，负载量越低，但是可以合成长链的核酸（表1）。PS 微球载量要远高于 CPG，载量可达 200-400 µmol/g，在合成短链核酸方面有着巨大的优势。
图3. 多孔玻璃微球在电镜下的孔道结构
表1. 不同孔径 CPG 的载量和适用范围
第一代 CPG 上多将核苷预修饰在孔道表面，预修饰的核苷即为目标序列的3’端的第一个核苷（如图4）。该类修饰目前已较少使用。目前市面上的主要产品是通用型的修饰（如图5），CPG 上修饰的是含有桥环或者糖环结构的一些有机单元，在上面可以进行任意核苷序列的合成，具有非常好的通用性。
图4. 第一代核酸固相载体
图5. 第二代核酸固相载体
核酸固相合成的四个阶段
SYNTHESIS
脱保护
Deblock/Deprotection
核酸的固相合成主要分四个合成阶段，第一阶段为脱保护（deblock），有时也被称作 deprotection，该步骤使用有机酸对载体上的 DMT 单元进行脱保护，将羟基上的 DMT 单元切除，裸露出羟基。该步骤中使用的酸主要是 3% 的三氯乙酸在二氯甲烷中的溶液，也可以使用二氯乙酸在二氯甲烷中的溶液，大规模合成时，也可以使用二氯乙酸在甲苯中的溶液。
缩合
Coupling
第二阶段为缩合（coupling），该步骤将核苷亚磷酰胺单体在缩合试剂（activator）作用下和上一步裸露出来的羟基缩合，形成亚磷酸三酯。该步骤中使用的缩合试剂有四唑，5-乙硫基四唑（ETT），5-苄硫基四唑（BTT），4,5-二氰基咪唑（DCI）以及吡啶三氟乙酸盐等。
封端
Capping
第三阶段为封端（capping），该步骤将上一步没有和核苷亚磷酰胺单体完成缩合的羟基进行酰基化封端，避免该羟基参与后续的反应，引入杂质。该步骤使用两种试剂，cap A 和 cap B，其中 cap A 的主要成分为乙酸酐或异丁酸酐，溶剂为乙腈或四氢呋喃；cap B 的主要成分为1-甲基咪唑、吡啶或2,6-二甲基吡啶等有机碱，溶剂为乙腈或四氢呋喃。
氧化/硫代
Oxidation/Sulfurization
第四个阶段为（oxidation/sulfurization）。在氧化步骤中，主要使用碘将化学不稳定的亚磷酸三酯氧化为化学稳定的磷酸三酯。在硫代步骤中，使用硫代试剂将亚磷酸三酯转化为硫代磷酸三酯。
上述四个步骤为合成一个核苷的基本循环，当氧化结束后，在固相载体上就完成了一个核苷酸的增长；重复这个循环，就可以得到固载在载体上的目标核酸序列。